PBJ | 中国农大赖锦盛课题组建立植株中基于Type I CRISPR系统的靶向大片段敲除体系

2023年8月29日，中国农业大学国家玉米改良中心、玉米生物育种全国重点实验室赖锦盛教授团队在Plant Biotechnology Journal 上在线发表了题为“Targeted large fragment deletion in plants using paired crRNAs with type I CRISPR system”的研究论文。该研究利用Type I CRISPR系统，基于双crRNAs设计，在植物中建立了高效的靶向精准大片段敲除体系。

作为当前最具颠覆性、引领性的生物育种前沿技术，基因编辑技术在农业生物育种中具有重要的应用前景。当前，大部分的CRISPR系统主要被用于引入小的插入缺失和碱基替换等，从而实现对基因表达水平或功能的改变。然而，对于相对较长的调控元件如非编码区的敲除，或研究大的结构变异对表型的影响等都往往需要进行基因组大片段敲除。尽管目前已经有一些基因组大片段删除方法被报道，但其往往存在编辑效率偏低、编辑精度不高等问题。因此，建立一种高效精准的靶向大片段敲除方法具有重要的意义。

赖锦盛团队利用Type I CRISPR系统中cas3核酸酶的切割方向性，以“PAM-in”的形式进行了双靶点的设计，发现基于Dvu I-C和Eco I-E基因编辑系统建立的大片段敲除体系在植物中具有比基于SpCas9系统更高的大片段敲除效率(图1)。进一步分析发现，基于Dvu I-C系统的大片段敲除体系具有非常高的靶向缺失精度，其产生的近一半的缺失片段的两端都位于相应PAM位点上下游100 bp范围内，而且其至少可以诱导高达20 kb的片段缺失(图1)。Dvu I-C系统对spacer上的错配具有很高的敏感性，并表现出较低的脱靶率。

图1：基于成对的crRNAs设计的Dvu I-C系统具有高效的基因编辑活性

最后，研究团队证实Dvu I-C系统可以产生稳定的大片段缺失的转基因植株(图2)。在玉米和水稻中其稳定转基因植株诱导效率最高可达86.67%。通过比较T0和T1代植株的编辑类型，发现Dvu I-C系统诱导的大片段缺失可以稳定遗传。总之，基于双crRNA设计的Dvu I-C系统可以高效地应用于植物基因组大片段缺失，拓展了Type I CRISPR系统的应用范围。

图2 玉米GA20ox3 T1代转基因编辑植株具有半矮化表型

中国农业大学博士生李英男、中国科学院分子植物科学卓越创新中心博士生黄博宇和中国农业大学副教授陈建为该论文的共同第一作者。赖锦盛教授和陈建副教授为论文的共同通讯作者。南方科技大学朱健康院士、中国农业大学宋伟彬教授、辛蓓蓓副教授、赵海铭副教授为该研究提供了重要帮助。该研究得到了农业农村部、海南崖州湾种子实验室、崖州湾科技城管理局的资助。

图文：陈建